RAPA3G Probe qPCR MasterMix(with UDG)

商品屬性：

產品名稱	規格	貨號
RAPA3G Probe qPCR MasterMix(with UDG)	1ml	BJ-PJ6584
RAPA3G Probe qPCR MasterMix(with UDG)	25ml	BJ-PJ6584

商品介紹：

描述：

 RAPA3G Probe qPCR MasterMix 將熱啟動 RAPA3GDNA 聚合酶、反應 Buffer、dNTP 染料等試劑預混在一起，是一種 2×濃度的單組分預混試劑。該制品不含有 ROX 校正染料，適用于各種熒光標記探針，并且適用于各種定量 PCR機型。優化的反應緩沖液，使得該制品可用于單重及多重的探針法定量 PCR。制品中的 RAPA3G DNA 聚合酶為第三代 DNA 聚合酶，其具有最高的雜質耐受性，其對乙醇、胍鹽、肝素、血清、植物多糖多酚具有極高的耐受性，因此可用于粗樣品的直接定量 PCR 檢測(Direct PCR)。該酶經化學法修飾，在 50℃以下 100%無活性，只有 95 度條件下加熱 5min 后才能完全恢復酶的活力。因此該系統可以有效抑制非特異性 PCR 擴增，極大的提高了 PCR 擴增特異性。由于 RAPA3G DNA 聚合酶對 dUTP 具有極強的識別能力，該制品中的 dTTP 核酸堿基完全被 dUTP 所取代，因此擴增產物均包含 dUTP，在配合熱敏 UDG（該酶在 95℃熱變性 5min 后不可逆失活，不影響后續 PCR 反應）的條件下能達到最佳的防污染能力。在 10e5 copies 污染物的測試條件下，Ct 推遲 15 個以上（污染去除能力>99.997%）。
儲存：-20℃可保存 2 年。短期使用可放置 2-8℃，保存 3 個月。如出現白色沉淀溶解后使用，不影響反應性能。該試劑經 30 次凍融后性能無下降，因此不使用時請置于-20℃避光保存。
RAPA3G DNA 聚合酶對抑制物耐受性
SDS 0.01% Serum 2%
EtOH 5% Plasma Citrate 2%
Heparin 0.1IU/ml Gua SCN 0.25%
Hematin 30μM Trizol 0.5%
操作方法
1、按照如下組分配制 20 μl PCR 反應體系：
終濃度
2×RAPA3G Probe MasterMix(with UDG) 10 μl 1×
Primer F1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM
Primer R1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM
Probe1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM
其它引物和探針 X
DNA 模板 0.5~2 μl
ddH2O Up to 20 μl
2. 進行 Real-Time PCR 反應,通常采用兩步法，程序如下：
Stage 1 25℃ 2 min 去污染
Stage 2 95℃ 5 min 熱啟動
Stage 3
40 循環
95℃ 5 s 變性
60℃ 30 s 收集信號 退火/延伸
注意：退火延伸溫度可在 55-65℃調整
3. 在多數情況下，采用兩步法程序可獲得理想的擴增效果，在無法達到預期理想效果的情況下，也可采用三步法 PCR程序，程序如下：
Stage 1 25℃ 2 min 去污染
Stage 2 95℃ 5 min 熱啟動
Stage 3
40 循環
95℃ 5 s 變性
55℃ 10 s 退火
72℃ 30 s 收集信號 延伸
4. 反應結束后確認 Real-Time PCR 的擴增曲線和標準曲線。
注意：消化污染步驟中的溫度設置可在 25-37℃之間均可，無顯著差異，但高于 42℃以上的溫度會導致熱敏 UDG 消化能力急劇下降。