LAMP Loop DP-Probe (訂制品)

商品屬性：

產(chǎn)品名稱	規(guī)格	貨號(hào)
LAMP Loop DP-Probe (訂制品)	800Tx25μl	BJ-PJ6578

商品介紹：

描述：

該 DP-Probe(DisPlaceable Probe)為鏈置換熒光探針，專用于LAMP 的熒光擴(kuò)增。Loop DP-Probe 在搭配 HotStart Bst4.2 Basic 試劑時(shí)表現(xiàn)出極為出色的特異性，可以大幅降低非特異性擴(kuò)增。LoopDP-Probe Pair 是將 Loop 引物進(jìn)行改造（LF/B 任意一條均可），其由兩條標(biāo)記引物退火組成：熒光猝滅引物（5’IBFQ+Tail+Loop）和熒光報(bào)告引物（Tail 互補(bǔ)區(qū)+3’發(fā)光基團(tuán)），其不發(fā)熒光。在 LAMP反應(yīng)中 Loop 引物滲入到“啞鈴”結(jié)構(gòu)，由擴(kuò)增返回“啞鈴”延伸并置換游離的熒光報(bào)告引物，累積產(chǎn)生熒光信號(hào)。詳細(xì)的原理可參考文獻(xiàn) PMID: 33626039。有經(jīng)驗(yàn)的研究人員可根據(jù)參考文獻(xiàn)自行制備 LAMP Loop DP-Probe Pair，經(jīng)驗(yàn)不足的人員可委托  來(lái)制備， 提供三種熒光標(biāo)記的探針。需要客戶提供 Loop 序列，并指明需要的熒光標(biāo)記（FAM/JOE/ROX）。

eLAMP DP-Probe 試劑的開發(fā)簡(jiǎn)述
1. 引物的粗篩選
無(wú)論是變色、試紙條、熒光法 eLAMP 試劑的開發(fā)，前期的測(cè)試過(guò)程， 推薦采用價(jià)格較低的液體 HotStart Bst4.2 SYBR Green試劑（進(jìn)行粗篩選。通常篩選的引物為 3-5 組。10xeLAMP Mix：FIP/BIP=8 μM each; LF/LB=4 μM each.測(cè)試樣品：10e3、100、25、10Copies/管，NTC(16-32 重復(fù))
2.5xBst4.2 SYBR Green Mix 10 μl
10x ePrimer Mix 2.5 μl
HotStart Bst 4.2（8U/μl） 1 μl
模板 DNA/RNA X μlddH2O 到總體積 25 μl置于 70°C 反應(yīng) 45min，1min 收集一次熒光信號(hào)。

良好的引物組具有 以 下 特 性 (Ct) ：

10e3copies =5-10min; 25copies <15min;10Copies<20min, NTC 均>40min. 以上實(shí)驗(yàn)需要反復(fù)確認(rèn)，以確
保核心引物的工作效率，否則重新篩選，再進(jìn)行后續(xù)的其它測(cè)試。
2. Loop DP-Probe Pair 的制備
根據(jù)上述引物組的篩選情況，選取最佳引物組。在此基礎(chǔ)上改造LF 或 LB，改造哪一條效果更佳，必須經(jīng)過(guò)測(cè)試。下面以改造 LF為例進(jìn)行說(shuō)明。 通常提供 25x 的 LF DP-Probe Pair（或自行制備）。

注意：

（1）測(cè)試試劑更改為 HotStart Bst4.2 Basic 試劑。

（2）10xeLAMP Mix 引物濃度有調(diào)整。
10xeLAMP Mix：FIP/BIP=8 μM each; LB=4 μM；LF=3 μM.
2.5xBst4.2 Basic Mix 10 μl
10x ePrimer Mix 2.5 μl
25x LF DP-Probe Pair 1 μl
HotStart Bst 4.2（8U/μl） 1 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到總體積 25 μl
置于 70°C 反應(yīng) 45min，1min 收集一次熒光信號(hào)（注意根據(jù)探針熒光標(biāo)記，選取正確的熒光通道）。與 SYBR Green 結(jié)果相比來(lái)看，時(shí)間會(huì)滯后 1-3min。NTC 的控制會(huì)明顯提升。

此時(shí)可進(jìn)一步做后續(xù)的其它項(xiàng)目測(cè)試。
3. 如有試劑凍干制備的需求可采用如下幾種方案：
（1）(液體試劑)+PrimerMix 自行凍干（專業(yè)人員使用）。
（2）PrimerMix+(引物凍干劑)自行凍干，加入 (凍干球)。
（3）（HotStart Bst4.2），全程自行凍干（專業(yè)人員使用）。
（4）委托  進(jìn)行全體系凍干。