增加PCR特異性的引物特點

        細心地進行引物設計是PCR中最重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物可能會同擴增其他的非目的序列。下面的指導描述了一個可以增加特異性的引物所具有的令人滿意的特點：
1、典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。

2、選擇GC含量為40％到60％或GC含量映像模板GC含量的引物。

3、設計5'端和中間區為G或C的引物。這會增加引物的穩定性和引物同目的序列雜交的穩定性。

4、避免引物對3'末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。

5、避免3'末端富含GC。設計引物時保證在最后5個核苷中含有3個A或T。

6、避免3'末端的錯誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。

7、避免存在可能會產生內部二級結構的序列，這會破壞引物退火穩定性。

目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當計算引物Tm值時并不包括這些序列，但是應該對其進行互補性和內部二級結構的檢測。

有時候，對于引物設計僅了解有限的序列信息。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設計兼并引物。兼并引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據不同生物的堿基使用偏好，減少兼并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。不要在引物的3'端使用兼并堿基，因為3'端最后3個堿基的退火足以在錯誤位點起始PCR。使用較高的引物濃度（1μM到3μM），因為許多兼并混合物中的引物不是特異性針對目的模板。