實驗步驟：
1. 制備凍存液，凍存液比例：本實驗室采用70%基礎培養基+20%FBS+10%DMSO，不同實驗室及不同細胞可能略有差異，也可采用55%基礎培養基+40%FBS+5%DMSO；

2. 取形態良好，處于對數生長期的細胞，對其消化、離心 (1500rpm離心8min)、計數；

3. 根據細胞數量加入對應的凍存液，使細胞密度維持在300-500w/mL；

4. 小心用鑷子打開凍存管管蓋，每管分裝1-1.5mL含細胞的凍存液，擰緊蓋管，做好標記。

5. 分裝好的凍存管轉入程序降溫盒后直接放-80℃過夜；

6. 若沒有程序降溫盒，則按下列順序依次降溫：室溫→4℃20min→-20℃30min→-80℃過夜，注意轉移過程中要保冷，避免產生溫差或凍存管融化；

7. 從-80℃冰箱取出凍存管迅速轉移到液氮長期保存。

注意事項：

1. 為保持細胞最大存活率，一般都采用慢凍存融的方法。

2. 凍存物距液氮面越近溫度越低。標準的低凍速度為－1℃~12℃/分鐘，當溫度下降達－25℃時，下降速度可增至－5~－10℃/分鐘，到－100℃時則可迅速凍入液氮中。因此要適當掌握凍存物下降入液氮中的速度，過快能影響細胞內水分透出，太慢則促冰晶形成。

3. 初次凍存者在下降凍存時，宜先用細木棒伸入罐中探測液面位置，然后需用溫度計與凍存物并行的辦法，以觀測下降凍存物的速度、凍存物與液氮液面距離和溫度三者關系，當已掌握以上各參數和凍存技術熟練后，僅按下降時間和下降距離便可獲理想凍存效果。

4. 各種細胞對凍存速度的要求也不一樣；上皮細胞和成纖維細胞耐受性可能大些，骨髓干細胞－2~－3℃/分鐘合適；胚胎細胞耐受性較小，不宜太快。總之在一開始時，下降速度不能超過－10℃/分鐘。

5. 用什么防護劑合適和用量多大，要依細胞而定，初代培養細胞用DMSO 較好，一般細胞可用甘油；用量以較小為好。有人認為人皮膚上皮細胞貯存在20%-30%甘油中很好。

6. 原則上細胞在液氮中可貯存多年，但為妥善起見，凍存一年后，應再復蘇培養一次，然后再繼續凍存。

7. 將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護工作，以免凍傷

8. 注意自身的安全，對于來自人源性或病毒感染的細胞株應特別小心。操作過程中，應避免引起氣溶膠的產生，小心有毒性試劑例如DMSO，并避免尖銳物品傷人等。